絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その１０

まとめ

　絹フィブロインフィルムのプロテアーゼによる分解性を、プロテアーゼの種類、フィルム含有添加物の有無及び種類を変えて検討し、次のことがわかりました。

（１） トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼＥの３種類のプロナーゼのうち、最も高いフィルム分解性を示したのは、プロナーゼＥでした。

（２） ベタインを添加剤として含むフィルムの場合には、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼＥのどのプロテアーゼに対しても無添加のフィルムよりも高いフィルム分解性を示しました。

（３） ポリエチレングリコール６００を添加剤として含むフィルムの場合には、開始から２時間までの分解性は高いが、それ以降は低下しており、フィルムから溶出したポリエチレングリコール６００による抑止効果が推定されます。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その９

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼによる分解

添加剤の影響
　グリセリンを添加剤として含むフィルムのプロテアーゼＥによるフィルム分解性の場合を除き、フィルムの分解性は添加剤を含むフィルムの方が含まないフィルムより分解性が高い傾向を示しました。
　添加剤を含むフィルムの方が添加剤の作用でフィルムの結晶化度が低いため、プロテアーゼがフィルム内部まで浸透しやすく、分解が促進されたと推定されます。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その８

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼによる分解

添加剤による違い

　ポリエチレングリコール６００を添加剤として含む絹フィブロインフィルムの３種類のプロテアーゼによる分解性を図に示しました。
　経過２時間時点での分解性は高い値を示しました。しかし、それ以降の分解性は低く、溶出したポリエチレングリコール６００がプロテアーゼによる分解を抑制するためではないかと推定されます。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その７

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼによる分解

添加剤による違い
　ベタインを添加剤として含む絹フィブロインフィルムの3種類のプロテアーゼによる分解性を図に示しました。
　どのプロテアーゼに対しても無添加の場合より高い分解性を示しました。　プロテアーゼＥによる分解ではフィルム残存重量率は経過６時間で４０．９％まで低下し、高い分解性を示しました。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その６

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼによる分解
添加剤による違い
　グリセリンを添加剤として含む絹フィブロインフィルムの３種類のプロテアーゼによる分解性を図に示しました。
　トリプシン、キモトリプシンに関しては無添加の場合よりも経過時間あたりのフィルム重量の減少が大きく、幾分高い分解性を示しました。
　プロテアーゼＥに関しては、同等もしくは幾分低い傾向を示しました。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その５

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼによる分解
酵素による違い
　添加剤を含まない絹フィブロインフィルムの3種類のプロテアーゼによる分解性を、経過時間ごとのフィルム残存重量率の変化として図に示しました。
　フィルム重量残存率は、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼＥの順に低くなり、顕著な差も認められました。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その４

プロテアーゼによる分解性試験

　プロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼＥの３種類を使用しました。
　各プロテアーゼを０．５ｍｇ／ｍｌ含む緩衝溶液（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣＬ，１４０ｍＭＮａＣＬ，ｐＨ７．５）２０ｍｌを１００ｍｌの栓付き三角フラスコに採り、その中へ約１ｇの絹フィブロインフィルムを加え、３７℃で保温しながら振とうしました。２時間、４時間、６時間後に三角フラスコ中の未分解残渣をガラスフィルター（Ｇ２）で濾過後、蒸留水で洗浄しました。残渣を乾燥して重量を測定し、フィルムの残存重量を求めました。
　プロテアーゼを含まない緩衝溶液で同様の操作を行い、添加剤の溶出によると推定される重量減少を求め、先に求めたフィルムの残存重量よりその値を引いた値を正味のフィルム残存重量としました。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その３

　絹フィブロインフィルムの作成

（１） 絹フィブロイン水溶液の調製
　絹繊維を９M臭化リチウム水溶液で溶解。溶解液をセルロースチューブに移し、透析。透析により臭化リチウム（臭素イオンとリチウムイオン）を除き、絹フィブロイン水溶液を調製しました。

（２） 絹フィブロインフィルムの作成
　６％絹フィブロイン水溶液を水平に保たれたアクリル板上に塗布し、自然乾燥で溶媒の水を蒸発させ、絹フィブロインフィルムを得ました。次にこのフィルムをアクリル板よりはがし、５０％エチルアルコール中に浸漬後、取り出して乾燥しました。この操作により水溶性であった絹フィブロインフィルムが不溶性に変化しました。

（３） 添加剤を含む絹フィブロインフィルムの作成
　グリセリン、ベタインあるいはポリエチレングリコール６００を添加剤として含む絹フィブロインフィルムの場合には、６％絹フィブロイン水溶液中に１％濃度になるように各添加剤を加え、この水溶液を水平に保たれたアクリル板上に塗布し、自然乾燥で溶媒の水を蒸発させ、絹フィブロインフィルムを得ました。このフィルムは既に水に対して不溶性になっているので、エチルアルコールによる不溶化の操作は行いませんでした。　

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その２

　プロテアーゼ分解性に対するフィルム添加剤の影響を調べました。

　分解されにくいとされる絹フィブロインフィルムですが、フィルム製法の違いや添加剤の影響により、分解されやすくなることもあるのではないかと考えたためです。

　絹フィブロインフィルムには、フィルム柔軟化の目的で、グリセリン、ベタイン、ポリエチレングリコールなどが添加されることがあります。

絹フィブロインフィルムのプロテアーゼ分解性 その１

　プロテアーゼによる分解において、絹フィブロインは毛髪ケラチンより分解されにくいことが報告されています。

「ヒト毛髪たんぱく質と絹フィブロインから成る複合フィルムの作成と性質」藤井敏弘、荻原大祐、松岡和法、奈倉正宣、繊維学会誌，62(11)，245-250(2006)

持続可能社会と絹

　再生産可能な絹繊維という資源。

シルクの用途（食品）

シルクの用途（変形）

シルクの用途（全般）

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その２１

　まとめ

　絹フィブロイン溶解液の脱塩において、拡散透析と電気透析を組み合わせた脱塩を試み、次のことがわかりました。

（１） 拡散＋電気透析では、透析外液をオーバーフローさせることなく電気透析により透析外液を循環させながら脱塩するので、使用水量を低減することができました。

（２） 絹繊維（絹フィブロイン）を溶解するためには高濃度の中性塩水溶液を使うため、透析チューブの内と外での濃度差が大きく拡散透析が有利な脱塩初期段階では拡散透析単独で脱塩を行い、濃度差が縮小して効率が低下した時点からは拡散＋電気透析で脱塩を行うことで使用水量の低減と徹底脱塩の両立が可能でした。

（３） 絹繊維を硝酸カルシウム水溶液で溶解して調製した絹フィブロイン溶解液を脱塩することで、ハロゲン化合物を生成することなく電気透析を行うことができました。　

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その２０

　脱塩Ａ、脱塩Ｂ、脱塩Ｃの脱塩（拡散＋電気透析）時における電導度低下の様子を図に示しました。
　脱塩Ｃは他の方法に比べ開始時の電導度が低く、また、脱塩機能の低下もあまりみられず順調に電導度が低下しました。
　セルロースチューブの内側と外側での濃度差が大きく拡散透析の効率が高いときには拡散透析単独で脱塩を行い、濃度差が低下し効率が低くなった時点で電気透析と組み合わせた脱塩に切り替える脱塩Ｃが有効な方法でした。

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１９

　脱塩Ｃ法で絹フィブロイン溶解液５０ｍｌを脱塩する際の総使用水量は２２５０ｍｌでした。脱塩対象の溶解液が２倍の１００ｍｌであれば、総使用水量も２倍の４．５Ｌと推定されます。
　以前の実験で、拡散透析のみで絹フィブロイン溶解液１００ｍｌを脱塩した際の総使用水量は３５Ｌでした。従って拡散透析と電気透析を組み合わせることにより、使用水量を１／７まで減少できることがわかりました。

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１８

脱塩条件の比較

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１７

　脱塩条件をＡ、Ｂ、Ｃと変えて脱塩したときの、使用水量、最終電導度などの値をまとめました。

（１） 脱塩方式
　　Ａ：拡散＋電気透析
　　Ｂ：拡散＋電気透析
　　Ｃ：拡散透析　→　拡散＋電気透析

（２） 絹フィブロイン溶解液量　５０ｍｌ

（３） 拡散透析時間
　　Ａ，Ｂ　ともに０分
　　Ｃ　　　　２１０分　

（４） 拡散＋電気透析時間
　　Ａ　１９００分
　　Ｂ　１８００分
　　Ｃ　１９００分

（５） 入れ替え蒸留水量
　　Ａ、Ｂ　　　０ｍｌ
　　Ｃ　　１０００ｍｌ

（６） 追加蒸留水量
　　Ａ、Ｂ　　　０ｍｌ
　　Ｃ　　　２５０ｍｌ　

（７） 総使用水量
　　Ａ　　２５００ｍｌ
　　Ｂ　　１０００ｍｌ
　　Ｃ　　２２５０ｍｌ

（８） 開始時電導度
　　Ａ　　　２．２ｍＳ
　　Ｂ　　２３．０ｍＳ
　　Ｃ　　　６．５ｍＳ　

（９） 電導度最高値
　　Ａ　　１８．０ｍＳ
　　Ｂ　　３２．０ｍＳ
　　Ｃ　　　６．８ｍＳ

（１０）最終電導度
　　Ａ　　１２．０ｍＳ
　　Ｂ　　２６．０ｍＳ　　
　　Ｃ　　０．４７７ｍＳ

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１６

　脱塩Ｃの場合の電圧（Ｖ）、電流（Ａ）、電導度（ｍＳ）の経時変化を図に示しました。
　脱塩Ｃはセルロースチューブの内と外で濃度差の大きい時には拡散透析だけを行い、濃度差が小さくなってからは拡散＋電気透析を行う方法です。
　電気透析を始める際の透析外液の電導度が６．８ｍＳと他の方法に比べ低いので、３５時間の処理で０．５ｍＳまで脱塩することができました。更に処理時間をかければ現状の処理能力２０ｍｌ／ｈでも徹底脱塩は可能と推定されます。

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１５

　脱塩Ｂの場合の電圧（Ｖ）、電流（Ａ）、電導度（ｍＳ）の経時変化を図に示しました。
　脱塩Ａと脱塩Ｂの違いは、透析外液の量を２５００ｍｌから１０００ｍｌに減らした点です。
　透析外液の量を減らすことで総使用水量は減らせるものの、塩濃度は高くなるので電導度最高値が３２ｍＳとなり、電気透析に掛かる負荷は増加しました。
　現状の処理能力２０ｍｌ／ｈで０ｍＳまで徹底脱塩するには１８０時間、５００ｍｌ／ｈの処理能力で８時間と推定されます。

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１４

　脱塩Ａの場合の電圧（Ｖ）、電流（Ａ）、電導度（ｍＳ）の経時変化を図１に示しました。
　脱塩時間０分から３００分まではセルロースチューブの内と外で濃度が平衡に達していないため、電導度は低下だけでなく上昇も認められます。４００分以後、電導度の一定の低下が認められ脱塩が進んでいるのがわかります。電気透析装置の循環液量が１分当たり２０ｍｌのため、２５００ｍｌの外液を脱塩するには長時間を必要とします。また、１６００分以降は電導度の低下が止まり幾分上昇しました。
　脱塩停止後、脱塩カートリッジを装置からはずし確認したところ、膜に固形物の析出が認められました。この固形物はカルシウム化合物と推定され、カルシウム化合物の析出により脱塩機能が低下したと推定されました(図２)。
　図１中の４００分から１４００分の電導度曲線の傾きから推定すると、１時間あたりの電導度の低下は０．１８ｍＳでした。従って、電導度最高値１８ｍＳを０ｍＳまで脱塩するには１００時間以上必要です。
　脱塩時間を短縮するには電気透析装置の処理能力を上げる必要があります。実験で使用した電気透析装置の処理能力は１時間当たり２０ｍｌですが、２５倍の５００ｍｌ／ｈの処理能力の装置を利用すれば５時間への短縮も可能と推定されます。



　　　　　　　　　　　　　　　　図１






　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　図２

絹フィブロイン溶解液の脱塩方法（改良） その１３

　拡散透析においては透析外液をオーバーフローさせることで透析チューブ内と外で濃度差が常にある状態を作り、透析チューブ内から外へ塩イオンの拡散を起こさせ、チューブ内塩濃度を低下させていきます。
　拡散＋電気透析では透析外液はオーバーフローさせるのではなく電気透析装置へ導入して透析外液中の塩を脱塩して、新しい透析外液として戻します。この結果、拡散＋電気透析では透析外液を電気透析で脱塩を行いながら循環させることで使用水量の低減を図ることができました。また、電気透析装置には、絹フィブロインを含む水溶液が直接導入されることはないので、脱塩が進んでも絹フィブロインの凝固で導入パイプが詰まり循環が停止することもありませんでした。